非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、出血性、高傳染性的豬疾病。迄今為止，仍然沒有廣泛有效的疫苗和治療方式用于應對非洲豬瘟，通常依靠快速診斷和撲殺感染豬等手段對疫情進行有效控制。
目前，對于非洲豬瘟的診斷主要依賴于PCR技術，該技術依賴于儀器設備和專業(yè)操作人員，只能在實驗室中進行，無法滿足現場診斷的需求。等溫擴增技術，如重組酶聚合酶擴增（RPA）、滾環(huán)擴增（RCA）等，具有高效、簡便易行等優(yōu)勢，但其靈敏度有限，難以單獨用于分子診斷。通過與CRISPR-Cas系統(tǒng)聯用，靈敏度顯著提高，可增加分子診斷的準確性。然而，目前常用的單模式熒光檢測法或比色檢測法易受到環(huán)境干擾，造成檢測結果的不準確。
2023年5月11日，中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所馬英新課題組與湖北大學印文博士合作，在 Analytical Chemistry 期刊上發(fā)表了題為：Fluorescence and Colorimetric Analysis of African Swine Fever VirusBased on RPA-Assisted CRISPR/Cas12a Strategy 的補充封面論文。
該論文首次構建了基于RPA-CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的非洲豬瘟病毒（ASFV）比色-熒光雙模式檢測策略，通過構建新型磁珠-酶報告系統(tǒng)，結合RPA-CRISPR/Cas12a技術，實現了對ASFV基因的比色-熒光雙模式精準檢測。
該方法能實現對單拷貝病毒基因組檢測，可用于便攜式可視化診斷，且在臨床樣本應用中展現了良好的檢測性能，為病毒感染的快速、精準診斷提供了有力工具。
超高靈敏CRISPR-Cas12a分子診斷傳感器構建用于非洲豬瘟病毒感染快速篩查
本研究開發(fā)了一種結合RPA、CRISPR/Cas12a和磁珠-酶新型報告系統(tǒng)，用于ASFV基因的快速精準診斷的方法。如圖1所示，biotin-ssDNA-azide與DBCO修飾的堿性磷酸酶（ALP）通過點擊化學反應合成biotin-ssDNA-ALP，biotin-ssDNA-ALP與鏈霉親和素修飾的磁珠（SA-MB）結合獲得MB-ssDNA-ALP報告系統(tǒng)。用RPA擴增ASFV基因序列，獲得擴增子，擴增子與Cas12a-crRNA復合物結合，激活Cas12a反式切割活性，切割MB-ssDNA-ALP上的ssDNA，釋放ALP；ALP催化pNPP水解生成pNP，引起比色信號變化，再加入量子點作為熒光報告子，實現比色和熒光的雙模式信號輸出。
圖1：探針構建及ASFV檢測原理圖。
biotin-ssDNA-azide與DBCO-ALP通過點擊化學反應獲得biotin-ssDNA-ALP，biotin-ssDNA-ALP與SA-MB偶聯獲得MB-ssDNA-ALP報告子。RPA擴增ASFV基因，擴增子激活Cas12a-crRNA復合物，Cas12a非特異性切割biotin-ssDNA-ALP報告子，釋放ALP；ALP水解pNPP，生成黃色pNP，加入藍色QDs后，在內濾效應作用下，藍色QDs熒光被猝滅。
在該研究中，團隊首先合成、表征了biotin-ssDNA-ALP，并驗證了biotin-ssDNA-N3與DBCO修飾ALP的偶聯以及MB-ssDNA-ALP探針的合成。然后，考察了RPA擴增ASFV基因的能力。以高度保守的ASFV B646L基因為靶標，設計了三對RPA引物，通過瓊脂糖凝膠電泳實驗驗證了三對引物都可高效擴增ASFV基因。接著，驗證了CRISPR-Cas12a靶向剪切ASFV基因的能力。設計靶向三個RPA擴增子序列的crRNA，利用瓊脂糖凝膠電泳驗證了Cas12a被激活并切割RPA擴增子。最后，結合合成的MB-ssDNA-ALP探針、RPA-CRISPR/Cas12a系統(tǒng)以及藍色CdZnSe QDs，實現了對ASFV基因的比色-熒光雙模式精準檢測，靈敏度達20 copies/mL，可視化檢測104 copies/mL（圖 2A-2D）。
磁分離技術的使用可有效降低背景信號，實現高信噪比檢測。對比發(fā)現本研究開發(fā)的檢測方法靈敏度高于qPCR，且具有良好的特異性，探針不與其它豬疾病相關病毒產生交叉反應。同時，還探究了該方法在實際樣本中的檢測能力，對12份豬血真實樣本進行了分析，結果顯示該檢測方法具有100%的準確度（圖2E和2F）。本方法結合熒光法的高靈敏度和比色法的易讀性，具有良好的靈敏度、便攜性和特異性，為病毒感染的快速、精準診斷提供了有效工具。
圖2 比色-熒光雙模式檢測ASFV基因。（A）不同濃度ASFV基因下，pNP的紫外光譜。（B）400 nm處吸光度與ASFV基因濃度的對數值之間的線性關系。（C）不同濃度ASFV基因下，CdZnSe QDs的熒光光譜。（D）熒光強度變化與ASFV基因濃度的對數值之間的線性關系。比色（E）和熒光（F）檢測方法用于臨床樣本的分析結果。可視化檢測結果均列于圖片上方。
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