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   金黃色鏈霉菌 Tü117 的準確靈敏檢測對于高血壓分類和早期預警至關重要。為實現(xiàn)這一目標，開發(fā)了一種雙重組酶聚合酶擴增與 crRNA 陣列介導的 CRISPR/Cas12a 檢測方法（DR-CAMCas），能夠實現(xiàn)多信號輸出，以精確識別和檢測金黃色鏈霉菌 Tü117。通過一步雙重 RPA 同時擴增金黃色鏈霉菌 Tü117 的 16S rDNA 和 LipReg4 基因，激活 crRNA 陣列介導的 CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)切割外源 FQ 報告分子，釋放熒光信號。DR-CAMCas 具有高擴增效率、通過 crRNA 陣列信號疊加實現(xiàn)多位點識別以及 CRISPR/Cas12a 的可編程性，實現(xiàn)了超靈敏檢測，線性范圍為 10 至 108 cfu/mL，檢測限約為 3 cfu/mL。DR-CAMCas 成功地在高鹽飲食誘導的高血壓小鼠和高血壓患者的糞便樣本中檢測到金黃色鏈霉菌 Tü117，與 qPCR 結果相符，顯示出高可靠性和實用性。此外，DR-CAMCas 中的目標誘導切割 DNA 連接子使 AuNPs-DNA 探針分散，實現(xiàn)比色檢測。整合到側流傳感器上，DR-CAMCas 可通過簡單的可視條帶分析進行即時檢測。其三重信號輸出滿足不同的檢測需求，為診斷鹽敏感性高血壓提供了一種有前途的工具。

（A）crRNA 陣列的結構、自由能和瓊脂糖凝膠。（B）crRNA 陣列的識別位點、雙重 RPA 過程以及 crRNA 陣列介導的 CRISPR/Cas12a 檢測信號的疊加效應。（C）crRNA 陣列的瓊脂糖凝膠。（D）雙重 RPA 和單獨 RPA 產物的瓊脂糖凝膠。（E、F）使用不同 crRNA 檢測 16S rDNA 和 LipReg4 基因的熒光光譜（金色鏈霉菌 Tü117：107 cfu/mL）。

單鏈向導 RNA（single crRNA）介導的 CRISPR/Cas12a 與雙重重組酶聚合酶擴增（dual RPA）耦合對 16S rDNA 和 LipReg4 基因的熒光響應（A、B）以及隨時間變化在不同單鏈向導 RNA 存在下的熱圖。（E、F）使用單鏈向導 RNA 介導的 CRISPR/Cas12a 與雙重 RPA 耦合檢測 16S rDNA 和 LipReg4 基因的檢測性能。

DR-CAMCas 方法對金色鏈霉菌 Tü117 檢測的檢測性能。（A、B）DR-CAMCas 檢測對 16S rDNA 和 LipReg4 基因的熒光響應隨時間變化。（C、D）在不同 crRNA 存在下，由 16S rDNA 和 LipReg4 基因誘導的 DR-CAMCas 終點熒光熱圖。（E）使用 DR-CAMCas 對金色鏈霉菌 Tü117 的識別過程。DR-CAMCas（crRNA1 + 2 + 3）對金色鏈霉菌 Tü117 的 16S rDNA 和 LipReg4 基因的熒光響應（H、K）和選擇性（H、K）。（G、J）使用不同 crRNA 組合的 DR-CAMCas 對 16S rDNA 和 LipReg4 基因的檢測性能。

（A）高血壓患者和高鹽飲食誘導的高血壓模型小鼠的糞便樣本。（B）金色鏈霉菌 Tü117 的革蘭氏染色。比例尺：20μm。高鹽飲食小鼠對體重（C）、收縮壓（D）、舒張壓（E）和平均動脈壓（F）的影響（n = 12）。（G - J）使用 DR-CAMCas 和 qPCR 檢測高血壓小鼠糞便樣本中的 16S rDNA 和 LipReg4 基因（對照組：6 只；血管緊張素 II 組：6 只；高脂飲食組：6 只；高鹽組：24 只）。（L - O）使用 DR-CAMCas 和 qPCR 檢測臨床樣本（正常人：30 人；高血壓患者：30 人）糞便樣本中的 16S rDNA 和 LipReg4 基因。（K，P）評估 DR-CAMCas 和 qPCR 在臨床樣本檢測中的一致性。*p < 0.05 與對照組相比，**p < 0.01 與對照組相比，****p < 0.0001 與對照組相比。

比色探針的表征。金納米粒子的 TEM 圖像（A、B）、映射圖像（C）和 EDS 分析（D）。（B）系列金納米粒子稀釋液的紫外-可見吸收光譜。（F）金納米粒子、金納米粒子-DNA 以及與 DNA 連接子交聯(lián)的金納米粒子-DNA 對的紫外-可見吸收光譜。（G）用 Arm-DNA 修飾前后的金納米粒子的 Zeta 電位。（H）比色檢測可行性評估。使用 DR-CAMCas 測定法與目標 DNA 反應后比色探針的 TEM 圖像（I）和元素分析（J-M）。使用 DR-CAMCas 測定法在沒有目標 DNA 的情況下比色探針的 TEM 圖像（N）和元素分析（O-R）。

金黃色鏈霉菌 Tü117 的比色法和即時檢測。（A）金黃色鏈霉菌 Tü117 的肉眼檢測過程。照片（B、C）金黃色鏈霉菌 Tü117 濃度增加時 16S rDNA 和 LipReg4 基因肉眼檢測的紫外-可見吸收光譜（D、H）及相應的線性擬合曲線（E、I）。（F、J）比色 DR-CAMCas 方法對金黃色鏈霉菌 Tü117 檢測的選擇性。（G、K）比色 DR-CAMCas 檢測法在高血壓小鼠糞便樣本檢測中的實際應用。（L）DR-CAMCas 在側流生物傳感器（LFB）中的整合?；?DR-CAMCas 的 LFB 檢測法對金黃色鏈霉菌 Tü117 的 16S rDNA 和 LipReg4 基因檢測的可行性（M）、檢測性能（N、P）和選擇性分析（O、Q）

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